Biacore T200全功能分子相互作用分析儀是一種萬用的、無標記系統(tǒng)，它具有*的靈敏度和*低的噪音。用于生物分子作用的詳細分析，適用范圍從早期藥物開發(fā)研究到開發(fā)，直至質(zhì)量控制。 系統(tǒng)提供高質(zhì)量動力學、親和性、濃度、特異性、選擇性以及熱動力學作用數(shù)據(jù)，這些分析均實時地、高靈敏度地完成。 此系統(tǒng)可以更高的精度和自信度完成動力學范圍末端發(fā)生的相互作用分析。

推進無標記作用分析的檢測限

Biacore T200 的靈敏度確保對*小有機成分的親和性分析，并且其分析功能可延伸到的動力值測定領域。 這樣就可能先前獲得的邊界數(shù)據(jù)進行可靠的解釋，從而完成對*簡便分析物的動力學分析，以及對低冗余度蛋白質(zhì)的檢測。

性能范圍

Biacore T200 支持使用 96 孔和 384 孔微孔板以及試瓶。 由于同時使用四個流動池要，可同時對四種相互反應進行監(jiān)測。 Biacore T200 的樣本倉可冷卻至 4°C，從而可在無人看護的情況下，對敏感型樣本進行長達 48 小時的分析。

保證易用性的軟件向?qū)Ш湍０?

Biacore T200 軟件適用于具有不同經(jīng)驗水平的用戶。 軟件向?qū)г谡麄€分析過程均可提供支持，從開發(fā)直至數(shù)據(jù)解讀，簡化了整個過程并縮短了獲取結果的時間。

快速、簡便的動力學分析

Biacore T200 軟件提供了大量的工具，幫助用戶進行自信且可靠的動力學分析。 這些分析可采用多周期法或單周期動力學分析法來完成。

? 一個平臺即可完成高質(zhì)量的綜合鑒定，包括動力學、親和性、特異性、濃度以及熱動力學的鑒定

? 增進對分子機理以及結構-功能關系的理解

? 定義潛在的藥靶和診斷標記物

? 選擇和鑒定生物療法候選藥

? 藥物開發(fā)過程中選擇和優(yōu)化前導成分

? 免疫原性研究中檢測和鑒定耐藥性抗體

（一）T200技術參數(shù)

（二）T200性能表現(xiàn)

一、擴展非標記相互作用分析的檢測極限

Biacore T200專為要求高靈敏度的分子間相互作用的分析而設計：

1）小的有機化合物（無*低分子量限制）

2）低豐度分子（濃度大于10pM）

3）稀有或敏感的靶蛋白，如G蛋白偶聯(lián)受體

4）避免了分析與二價抗體之間相互作用時親和效應的干擾

5）微弱相互作用分析，K_D在mM范圍內(nèi)

6）穩(wěn)定的結合物，k_d≥10^-5 S^-1

1、測定稀有或敏感靶蛋白

從低水平捕獲蛋白獲取高質(zhì)量數(shù)據(jù)有利于分析小分子和諸如G蛋白偶聯(lián)受體等敏感蛋白的相互作用，而這些蛋白往往是*重要的藥物靶蛋白。而Biacore T200的高靈敏性意味著蛋白固定后僅需小部分分子保留活性即可用于分析。此外，稀有靶蛋白使用量較少，使得消耗降低的同時并不影響數(shù)據(jù)質(zhì)量。敏感靶蛋白的研究因此更加可信，縮短了藥物發(fā)現(xiàn)過程中的檢測時間。

2、分析方法設計更加靈活

在評估抗體用作治療、分析或診斷工具的適用性時，對抗原-抗體相互作用進行全面特征鑒定很重要。當利用Biacore進行抗原-抗體分析時，通常情況下建議將抗體固定于傳感器表面以免其親和作用（Avdity Effect）影響數(shù)據(jù)解讀。然而，在特定情況下，人們更傾向于固定抗原，這是出于節(jié)約珍貴靶分子的考慮或抗原分子更易于固定。Biacore T200的高靈敏度足以降低抗原捕獲水平以避免親和效應，進而使得分析方法的設計可以靈活多樣。

3、更廣動力學范圍內(nèi)的高度性分析

Biacore T200中的微流控系統(tǒng)經(jīng)過優(yōu)化以用于高質(zhì)量的動力學分析。四個流動池可靈活用于單一的、配對的或者系列運行。配對的芯片上流動池接口使得流動池之間的空間被降到*低水平，確保了的標準差減。

Biacore T200可以測定從*快的結合速率到*慢的解離速率的*廣范圍內(nèi)的動力學常數(shù)。這可用于對強結合物進行排序，這一點對于抗體篩選非常重要。此外還可以用于檢測快速結合的相互作用物之間的差別，這在收到生物利用率限制的生物學過程的研究中非常重要。

1）k_a從10³到5X10⁷M^-1s^-1（對于大分子待檢物為10³到3X10⁹ M^-1s^-1）

2）k_d從10^-5到1s^-1

二、性能范圍

1、自動運行條件下可分析高達384種樣品

Biacore T200支持96和384孔板和小瓶的使用。四個流動池的使用使得四種相互作用可被同時檢測。Biacore T200的樣品槽可以降溫到4℃，使得敏感樣品可以在高達48小時無人值守的運行中得以分析。

2、在生理溫度下研究分子間相互作用來預測體內(nèi)狀態(tài)的情況

通過提高在生理溫度下測定的可靠數(shù)據(jù)，Biacore T200確保更加準確地預測體內(nèi)狀態(tài)下的治療性分子的特性。系統(tǒng)一體的緩沖液除氣裝置防止在溫度升高的情況下形成氣泡，有助于確保更高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。此外，一體的除氣裝置也可以省略運行前對緩沖液進行的除氣操作。

3、運行緩沖液篩選有助于快速分析方法開發(fā)

內(nèi)置的緩沖液選擇裝置在每次運行中可*多測試四種緩沖液，加快了分析方法的開發(fā)。例如，結合特性的微環(huán)境效應可在機制性和穩(wěn)定性研究中進行分析。

4、回收樣品以用于質(zhì)譜鑒定

Biacore T200結合質(zhì)譜為在功能性結合標準的基礎上鑒定蛋白質(zhì)提供了可能。樣品的回收及消化均具有軟件支持。

1）被分析物以很小的體積被回收，使得濃度*化。

2）從樣品到回收溶液盡可能減少殘留。

3）在含有消化溶液的瓶中沉淀。

4）軟件模板預先設置有整個回收過程。

三、快速、簡單的動力學分析

Biacore T200軟件為可信的和準確的動力學分析上提供了廣泛的工具?？墒褂枚嘌h(huán)方法；或者采用單循環(huán)動力學分析：由于不需要進行每次注入樣品之間的表面再生過程，單循環(huán)動力學分析使得那些涉及難以再生的靶蛋白分析能夠?qū)崿F(xiàn)，并且縮短了分析開發(fā)的時間。

Biacore T200數(shù)據(jù)評估軟件可使分子間相互作用的動力學分析通過幾個簡單的點擊來實現(xiàn)。

1）同時處理多重樣品以簡化數(shù)據(jù)分析過程并且節(jié)省時間

2）使用一個或幾個現(xiàn)有的相互作用模型擬合動力學數(shù)據(jù)

3）自動減去參照和空白對照數(shù)據(jù)

（三）經(jīng)典應用

1、繪制凋亡信號通路

通過研究點突變凋亡蛋白和細胞表面受體之間的相互作用可以揭示出細胞內(nèi)的信號傳導通路。

研究表明，凋亡蛋白LIGHT可與兩種細胞受體：淋巴細胞毒素-β受體（LTβR）和皰疹病毒穿入介質(zhì)（HveA）相結合。通過在可能參與受體結合的肽環(huán)處引入點突變，Biacore方法可考查這些突變對LIGHT蛋白結合特性的影響。

實驗對野生型和LIGHT突變體與其受體間的相互作用分別進行了研究。通過抗體捕獲技術講HveA蛋白和LTβR蛋白固定于傳感芯片表面。體外分析發(fā)現(xiàn)，其中一種LIGHT突變體可以與HveA蛋白結合，卻不能與LTβR蛋白相結合，也沒能導致靶細胞的凋亡。這些結果有力的暗示，LIGHT通過與其細胞表面受體相互作用時至少激活了兩條不同的信號通路，而且只有其中一條通路會引發(fā)凋亡。

2、配體垂釣

從細胞條件培養(yǎng)基中鑒定與細胞表面受體相互作用的可能配體。

將一個含細胞表面受體Flt4胞外域的Fc融合蛋白固定在傳感芯片表面。將來自100種不同細胞系的濃縮培養(yǎng)基流經(jīng)芯片表面。當把這些培養(yǎng)基用生物學方法檢測時，只有在Biacore實驗中能與Flt4結合的培養(yǎng)基才能夠誘導穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細胞中的Flt4受體發(fā)生酪氨酸磷酸化。

隨后，經(jīng)過親和層析柱的分離和SDS-PAGE電泳，三種與Flt4結合活性相關的多肽被收集。

由收集到的其中兩種肽段中部分氨基酸序列合成變性PCR引物，擴增出一個65 bp的產(chǎn)物。測序結果顯示，該產(chǎn)物中含有一段和已知氨基酸序列完全匹配的序列。這段cDNA被用來鑒定Flt4的配體，確認該蛋白在新轉(zhuǎn)染細胞中的生物功能，同時還可以用于發(fā)現(xiàn)與其功能相關的生長因子的同源區(qū)域，從而研究這些配體的基因表達狀態(tài)。

3、蛋白-蛋白相互作用

研究多組分蛋白復合體對生物過程的調(diào)節(jié)

補體旁路（alternative complement）蛋白C3b部分受到血漿蛋白因子H（fH）的調(diào)節(jié)。通過對fH與表面結合蛋白C3b相互作用位點進行鑒定，有助于理解補體旁路為什么只會被異己組織激活。

將C3b連同其蛋白水解片段C3c和C3d固定于芯片表面。 將8個fH片段通過注射流經(jīng)芯片表面，結果發(fā)現(xiàn)血漿蛋白因子H (fH) 上存在三種不同的與C3b結合的位點。

每個fH片段都與C3b上不同的位點相互作用。位點1僅與完整的C3b作用，位點2與C3b和C3c結合，而位點3與完整C3b和C3d片段結合。C3b和fH之間的多重交互作用對于理解補體旁路與異體和宿主結構之間存在的專一反應性提供了分子基礎。

4、Biacore系統(tǒng)與質(zhì)譜

Biacore系統(tǒng)與電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜技術（ESI-MS/MS）聯(lián)合為研究者提供一種新的分析方法，用來捕獲發(fā)生相互作用的蛋白并進行回收與鑒定。該技術提供了一整套包含檢測、捕獲及回收中低飛摩爾量級蛋白的方法。

將三磷酸肌醇（IP3）固定在芯片表面，將轉(zhuǎn)化有IP3結合蛋白的細菌裂解物流經(jīng)芯片表面。隨后，通過空氣隔斷的方法（air partition method）將微量的胰酶送至結合蛋白處進行消化。酶解的肽段通過反相毛細管柱富集并除去了可能干擾質(zhì)譜分析的雜質(zhì)。從反相上洗脫的肽段混合物通過液質(zhì)聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)進行分析，*終確定IP3結合蛋白的存在。

5、檢測臨床實驗中治療抗體的免疫源性

作為治療藥物，小鼠抗體由于會激起機體免疫應答而受到限制。紐約Ludwig腫瘤研究中心的研究人員構建出一個人源化的小鼠單克隆抗體藥物，該藥物將CDR區(qū)域嫁接進人IgG骨架，能識別人結腸上皮和結腸癌中特異表達的一種標記物。這種嵌合抗體在患有結腸癌的病人身上進行I期和II期臨床檢測，其免疫源性通過無標記蛋白相互作用分析進行監(jiān)控。

將人源化抗體（huAb A33）固定在傳感芯片表面，并在制備好的芯片表面注入病人的血清。反應人群被大體劃分為兩大類。 I型反應人群的特點是在2周時間內(nèi)血清中出現(xiàn)有抗huAb A33的抗體，盡管病人持續(xù)接受huAb A33治療，但抗huAb A33抗體的滴度開始不斷下降。而另一邊，II型反應人群的免疫應答反應較緩慢，但隨著治療的繼續(xù)，抗體滴度持續(xù)增加。在后一組中，生理性不良反應比I型更加頻繁，因此，*終停止了使用huAb A33對這些病人進行治療。

此外，病人抗體響應的亞類也可通過Biacore夾心檢測進行鑒定。簡言；所有病人樣品當預先將蛋白G加入稀釋血清后（去除IgG）其抗huAb A33反應幾近消失，而有一些病人采用正辛酸處理（沉淀所有的非IgG蛋白）則沒有太大的影響。極少的病人在用蛋白G處理血清后仍有殘留的活性存在，這些信號可通過向傳感芯片表面注入抗IgM抗體檢測到。

具有II型反應的病人數(shù)周內(nèi)都沒有出現(xiàn)不良生理癥狀，直到幾周后，用Biacore檢測到抗huAb A33抗體水平持續(xù)增加。因此研究人員可以采用無標記蛋白相互作用分析對可能出現(xiàn)的不良反應進行預測。

（四）實際案例

1、蛋白-蛋白相互作用

配體：蛋白HSA

分析物：蛋白HE，~6KDa

ka(1/Ms)=2.434*E5    kd(1/s)=9.89*E-4    KD(M)=4.064*E-9

SE(Ka)=3.9*E+2       SE(kd)=1.3*E-6

從傳感圖得知，實驗*監(jiān)測到信號，信號明顯且呈現(xiàn)良好的濃度依賴性。

數(shù)據(jù)QC模塊顯示數(shù)據(jù)分析結果合理科學，結果真實可信。