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免疫組化(IHC) 實驗注意事項

來源: 上海撫生實業(yè)有限公司 >> 進(jìn)入該公司展臺 2022/07/05 14:47:27 已瀏覽:
導(dǎo)讀:免疫組化(IHC) 實驗注意事項


IHC(免疫組化)融合了免疫學(xué)原理(抗原抗體特異性結(jié)合)和組織學(xué)技術(shù)(組織的取材、固定、包埋、切片、脫蠟、水化等),通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色,來對組織(細(xì)胞)內(nèi)抗原進(jìn)行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。IHC 實驗注意事項:


1. 組織取材


為避免蛋白丟失及組織受損引起的非特異試劑吸附,取材須快速(組織塊也不宜太大)且要盡量避免人為損傷。


2. 固定


固定要及時、,但也不能固定過久。實驗證明甲醛固定時間越久的組織越容易出現(xiàn)自發(fā)熒光及非特異性染色。一般以 12~36 小時*。


3. 石蠟片與冰凍片的選擇


石蠟片制作對設(shè)備要求較冰凍片低,組織結(jié)構(gòu)更好,保存條件簡單時間也久。但對部分蛋白有較強(qiáng)烈的破壞作用,對蛋白保護(hù)較冰凍片差。冰凍片對蛋白的保護(hù)較石蠟片好,制作起來也較快。


4. 滅活


過氧化物酶(HRP)系統(tǒng)的一定要做內(nèi)源性過氧化物酶的滅活,而對于堿性磷酸酶(AP)系統(tǒng)和免疫熒光這個步驟不需要做。


5. 抗原修復(fù)


不同的樣本、不同的蛋白其*的抗原修復(fù)方式會有所區(qū)別,熱修復(fù)(酸性修復(fù)液(檸檬酸鹽修復(fù)液)、堿性修復(fù)液(EDTA 修復(fù)液)及酶修復(fù)(蛋白酶)都可做嘗試。對于陳舊的樣本要增加修復(fù)強(qiáng)度,比如延長修復(fù)時間。


6. 封閉


常用的封閉液有 5% BSA 和血清。BSA 是通用型的封閉液。血清應(yīng)選擇與二抗同源的血清。


7. 抗體孵育


一抗一定要與實驗及樣本匹配的,孵育條件以 4 ℃ **。二抗應(yīng)匹配一抗,37 ℃ 孵育半小時即可。


8. 顯色


DAB 顯色建議在鏡下控制反應(yīng)時間,在陽性及背景之間選擇平衡點(diǎn)。


9. 結(jié)果觀察


建議在數(shù)據(jù)庫中查詢準(zhǔn)確的表達(dá)部位。

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