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反應(yīng)步驟:
1、變性:利用高溫(93-98℃)使雙鏈DNA解螺旋,高溫使兩條DNA鏈間的氫鍵斷裂。在*個循環(huán)之前,通常加熱時間較長以確保模板DNA完全分離,僅以單鏈形式存在。該步驟時間1-2分鐘,接下來機器就控制溫度進入循環(huán)階段。
2、退火:將反應(yīng)溫度降低至50-65℃(通常比引物 值低3-5℃)持續(xù)20-40s,從而使引物結(jié)合于單鏈DNA上。若退火溫度過低,容易造成非特異擴增,而退火溫度過高,引物可能根本不結(jié)合。
3、延伸:此步驟的溫度取決于所用的DNA聚合酶。 Taq(Thermus aquaticus)聚合酶的熱穩(wěn)定DNA聚合酶的*活性溫度約為75–80°C,但通常使用的延伸溫度為72°C。 在這一步驟中,DNA聚合酶通過從反應(yīng)體系中添加的5'至3'方向的游離dNTP,從而合成與DNA模板鏈互補的新DNA鏈。延伸所需的時間取決于所用的DNA聚合酶和待擴增的DNA片段的長度。 傳統(tǒng)的Taq 酶估計合成1000bp大概需要1分鐘、較新的Tbr 酶(來自于嗜熱菌Thermus brockianus)約40s、商業(yè)公司生產(chǎn)的融合型聚合酶僅需約10-15s。有修正功能的則會比較慢。
上述循環(huán)結(jié)束后,將進入終延伸階段:此步驟是可選的,但要在70-74°C)(PCR中使用的大多數(shù)聚合酶*活性所需的溫度范圍)下進行5-15分鐘。 *一個PCR循環(huán),以確保所有剩余的單鏈DNA的岡崎片段被補齊。
*終保持:*一步將PCR儀反應(yīng)室無限期地冷卻至4–15°C,可用于PCR產(chǎn)物的短期保存。
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