PCR使用的Taq酶應(yīng)該注意如下問(wèn)題

為彌補(bǔ)taq酶這一缺點(diǎn)常將克隆后的序列進(jìn)行測(cè)序，來(lái)確認(rèn)所擴(kuò)增序列的準(zhǔn)確性。同時(shí)也可采用保真度更高的Pfu DNAPolymerase，來(lái)確保擴(kuò)增的準(zhǔn)確性，Pfu DNAPolymerase有3 ’-5’的外切酶活性，5’-3’外切酶活性，是目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐高溫DNA 聚合酶中出錯(cuò)率Z低的。但PCR產(chǎn)物為平端，不能進(jìn)行Ta克??！而解決此問(wèn)題的辦法是使用TaqPlus DNAPolymerase，該酶是Taq 酶和pfu Polymerase的混合物，因此既能保證準(zhǔn)確性又能保證能夠進(jìn)行Ta克隆。在使用中應(yīng)該注意如下問(wèn)題：

1．25ul體系中一般用量為0.1ul（用槍頭沾一下即可），用量過(guò)多可能會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。

2.PCR體系構(gòu)建過(guò)程中Z后加入的一種成分，因此只有在其他試劑加完之后才可從冰箱中取出加入。

3.Taq酶中含有甘油，故不結(jié)冰，若結(jié)冰則應(yīng)丟棄。

4.對(duì)于預(yù)變性時(shí)間較長(zhǎng)的PCR反應(yīng)，應(yīng)在預(yù)變性即將結(jié)束后加入酶，減少長(zhǎng)時(shí)間高溫對(duì)酶活力造成的損傷。

5.保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的酶可以適當(dāng)增加用量。

PCR使用的taq酶在反應(yīng)時(shí)由于喪失3’——>5’外切核酸酶活性，因而不具有校正活性。在典型的一次PCR反應(yīng)中，taq酶造成的錯(cuò)誤的核苷酸錯(cuò)誤的摻入率大概為每20000個(gè)核苷酸中就有一個(gè)，雖然表面上看起來(lái)不會(huì)有多大的影響，但是在分子克隆中如果有一個(gè)錯(cuò)誤核苷酸摻入，很有可能造成移碼突變，影響是嚴(yán)重的